使用血液等体液样本进行的肿瘤分子标志物检测，或“液体活检”，由于实验及分析技术的进步，其在肿瘤治疗与预后管理中的参考价值正在被临床试验和实际应用所证实；
而新技术与检测指标的的开发又进一步拓宽了液体活检的临床应用范围。
液体活检技术相对于传统的组织切片，其最大的优势在于相比起传统组织切片的获取方式，即对患者的病灶进行手术切片，其操作便捷性有大幅提高，并且对患者的身体负担也大幅减小；
两者结合，能够更频繁、更及时的取样，也能更及时地反应患者疾病进展的最新动态。下面就对液体活检技术的发展及应用价值做部分介绍。
液体活检背景介绍
图1液体活检技术[1]
液体活检的根本在于一个近百年前发现的事实，即部分肿瘤特异性分子和肿瘤细胞会从肿瘤组织病灶上脱落到血液中；而针对血液中这些脱落肿瘤样本的的分析及其结果与癌症病理学表现与预后等方面的关联促成了液体活检的发展[2]。
不同的液体活检具体技术会分析样本中的不同肿瘤成分，例如DNA、RNA、蛋白质、整个肿瘤细胞，以及最近新兴的外泌体。
目前液体活检公认度较高，应用较为广泛的的技术为对cfDNA/ctDNA，CTC及外泌体的检测。循环游离DNA（cfDNA）是指被释放到血浆中的DNA片段，在癌症中cfDNA的水平相比正常人会有所提高[3]；
而循环肿瘤DNA（ctDNA）是指在血流中来源于肿瘤细胞的游离DNA，是cfDNA的一个子集。针对cfDNA及ctDNA的测序在一定程度上能反应整个肿瘤的基因组信息，对预后及治疗有指导意义与作用[4]。
循环肿瘤细胞（CTC）指从肿瘤病灶脱落进入外周循环血液的肿瘤细胞，针对CTC可以进行很多类似普通组织切片的操作，例如基因组测序，免疫组化检测等，其结果对患者的预后生存评估及治疗指导也有较为积极的作用[5]。
图2血液中各种可用于检测的成分（绿色为癌症病灶组织）[6]
现在液体活检研究的热点和尖端技术，集中在样本外泌体的检验上。外泌体是源于细胞“内吞-融合-外排”等调控过程而形成的胞外纳米级多泡体，在电子显微镜下呈现50nm-nm杯状或蝶形脂质双分子膜结构[7]。
目前已证实外泌体含有蛋白质、脂质、核酸等多种活性成分。其中蛋白质主要包含粘附蛋白、信号转导蛋白、分子伴侣、抗原提成蛋白等。核酸中既有信使RNA（mRNA）和微小RNA（miRNA）等外，也有单链DNA，线粒体DNA，以及双链DNA[8]。
图3外泌体示意图[9]
液体活检技术在免疫治疗指导上的进展与应用
液体活检技术应用在肿瘤预后及治疗指导，传统上多运用于化疗药物代谢，疗效及*性评估，以及靶向药物选用。不过随着免疫治疗概念成熟，技术发展及理念的普及，针对免疫治疗疗效评估的液体活检检测技术也在不断发展。
关于免疫治疗的概念，之前专题及文章已有过详细介绍，这里不再赘述。免疫治疗预后及疗效评估有几个公认度较高的指标，较为新兴的肿瘤突变负荷（TMB）以及长时间作为金标准的PD-L1.。
对于TMB，因为其的表现形式是细胞内特定DNA序列的不稳定性，即突变，使用前述的测序cfDNA/ctDNA的技术手段即可。
PD-L1作为细胞表面的一种蛋白，其传统测定方法是对病灶组织切片进行免疫组化染色，判断癌细胞表面是否有PD-L1异常表达；这使得液体活检检测PD-L1发展出了多种不同的解决方案，下面进行一些介绍。
图4PD-L1以及其在癌症与免疫系统之间的交互[10]
首先，最接近传统组织切片的检测方法，就是对CTC进行免疫组化染色。目前针对CTC表达PD-L1已经有了多个研究，研究结果表明，在CTC中PD-L1的表达与组织切片中PD-L1的表达相关性很强[11]，有些情况下PD-L1在CTC中生物表达甚至会高于其在组织切片中的表达[12]。
因此，使用CTC作为液体活检检测PD-L1表达是一种高度可行的技术手段，其难点在于CTC本身在样本中较为稀少[13]。
图5CTC进行PD-L1免疫荧光染色[14]
PD-L1作为一种蛋白能在患者的血浆或血清内被检出，因此，对患者血液内的可溶PD-L1（sPD-L1）进行直接检测，也是一种检测方法。研究结果表明血液中sPD-L1的水平与纳武利尤单抗治疗的疗效关系是统计学上显著的[15]，不过其他因素是否会对血液sPD-L1水平产生影响目前仍未有定论。
不过除此之外，目前针对PD-L1蛋白直接检测出现了一个新的突破口，就是外泌体PD-L1蛋白水平。
如前所述，外泌体会包含活性蛋白成分，其中也会有PD-L1的出现，具体取决于形成外泌体的细胞，因此对外泌体PD-L1进行检测是一个可行的切入点。
目前已有研究证实，外泌体PD-L1也会参与贡献免疫抑制，并且其水平与抗PD-1疗法疗效相关[16]。将抗PD-1疗法与外泌体消耗疗法联用，能降低肿瘤负担，提升总体存活时间[17]，对于治疗有指导意义。
图6外泌体PD-L1生成及转运模型[18]
最后，由于PD-L1本质上也是一种蛋白质，遗传的中心法则对其仍然适用，因此对编码PD-L1的遗传物质进行检测，是又一种解决方案。
由于DNA可能由于表观遗传学修饰与拷贝数等因素无法准确反映蛋白实际情况，实际检测中主要采用外泌体mRNA作为检测指标。
有实验已经证实，血浆外泌体mRNA的表达与黑色素瘤及非小细胞肺癌针对抗PD-1疗法的疗效统计学相关[19]，是一个有意义、有临床应用价值的治疗评估指导。
图7外泌体PD-L1与机体免疫系统的作用[18]
综上，液体活检在癌症治疗指导中有着许多独特的优势，其地位在各种实验中也渐渐得以巩固。
目前没有普及的最大障碍不是技术，而是熟悉程度及信赖程度的不足，不够让人放心的去用它[2]。
不过同时，也正如NCCN在每一种癌症的指南上都会写的一样，“专家组相信最佳的治疗方案为参与临床试验”，当医生与患者对液体活检技术的熟悉与信任上去之后，其一定会大放光彩。
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