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望夜
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#HIV#
每年全球仍有近万人感染人类免疫缺陷病毒（HIV-1），但目前尚无获批的疫苗。囊膜病毒入侵宿主由囊膜表面的糖蛋白介导，对HIV-1而言就是其Env蛋白，负责识别结合宿主细胞表面受体并完成膜融合过程，是中和抗体的唯一靶标，也是疫苗设计的主要靶蛋白。Env蛋白是由前体蛋白pg切割成熟而来，含gp和gp41两个亚基，两者由非共价键连接成异源二聚体进而组成Env同源三聚体，其中gp41可通过其跨膜区锚定在病毒囊膜上，C末端的胞浆结构域（CTD）位于病毒腔体内。在HIV-1出芽过程中，Env的CTD与未成熟的Gag蛋白的基质结构域（MA）互作，形成一个与膜结合的格栅（lattice），位于病毒双层膜的内层。
为获得均一稳定的Env三聚体结构，研究者此前通过在gp和gp41间引入一对二硫键（SOS），同时将gp41HR1螺旋上的异亮氨酸突变为脯氨酸（IP）的改造，构建出称为SOSIP的Env三聚体，并基于此构建解析出一系列Env结构。但由于SOSIP含有多处人为改造，是否可以真实反映天然状态Env三聚体的结构，目前仍有许多未知。
为分析在病毒颗粒表面的Env与其胞外可溶部分在结构上的差别，年2月4日，美国华盛顿大学的KellyK.Lee和Scripps研究所的MichaelB.Zwick研究组合作在Cell上发表了文章Cryo-ETofEnvonintactHIVvirionsrevealsstructuralvariationandpositioningontheGaglattice，借助冷冻电子断层成像（cryo-ET）技术，综合子断层扫描图平均化（sub-tomogramaveraging）和结构质谱技术分析了成熟和未成熟状态下带有Gag的HIV-1病毒样颗粒结构，揭示出天然状态下的HIV病毒颗粒结构的多变性。
在HIV-1病毒粒子表面，同时存在有功能但不稳定的Env三聚体及非天然状态的Env蛋白。为克服Env蛋白的异质性和不稳定性问题，MichaelB.Zwick组此前已通过直接进化获得一系列Env蛋白变体，本文使用的ADA.CMEnv即来自B型分离株ADA的一个变种并截去其C端结构域（CTD）C末端的个氨基酸。本研究使用称为hVLP的病毒样颗粒作为研究样本，其带有组装在Gag蛋白层之外的双层囊膜，而Gag的成熟需要经过酶切处理。hVLP含有与真实HIV-1颗粒相同的成分只是不具备复制能力，因为其包裹的病毒基因组缺乏Env基因，因而必须在表面表达有ADA.CMEnv的HEK细胞中方能包装出完整病毒颗粒。纯化后的hVLP还需经过一种温和氧化剂二硫二吡啶-2（AT-2）的处理以破坏核衣壳与RNA的相互作用，确保颗粒不再具有感染性。抗体结合实验显示AT-2处理未影响Env蛋白的抗原性；尽管不具有感染性，AT-2处理的hVLP处理仍可诱导被感染细胞产生合胞体及细胞毒效应，表明Env依然具备介导病毒入侵的能力。利用此种表面Env蛋白密度较高的hVLP，作者收集到足够的cryo-ET数据并最终处理获得分辨率9.1的HIV-1病毒粒子结构。
在获得的结构数据中，大部分hVLP都处于成熟状态，另有约3%的颗粒处于未成熟状态，其囊膜下显示出一层清晰规则的Gag格栅。对此部分子数据进行处理可获得较低分辨率的密度图，但其Env结构非常接近由完整数据获得的亚纳米分辨率的Env结构及此前已发表的Env胞外域结构。可将已发表的Env胞外域和六聚体Gag-CA结构匹配到相应密度中，但EnvTMD-CTD的密度未能出现在平均化后的结构中，表明跨膜区（TMD）未与Env胞外段或Gag-CA紧密连接。基于推测的TMD-CTD与Env胞外段的相对位置，可将前者结构匹配入密度图中。
未成熟状态GagN端的MA结构域以同源三聚体的形式沿着病毒囊膜内层组装成六聚体，MA通过一段柔性连接区与Gag-CA格栅层相连。在未成熟hVLP的断层图上可以清晰辨认出对应Gag-MA的规则排布的密点，就位于膜内层之下；但在平均后的密度图中却无法分辨出Gag-MA层的密度，作者推测Gag-MA格栅的排列可能相较于Gag-CA或Env的对称轴存在微小的差别。于是只能基于Gag-MA相对于Gag-CA的推测位置，将MA格栅的结构匹配入密度图中（图1）。于是EnvCTD与Gag-MA并排出现在膜内层底部，刚好与粗断层图吻合。而且在该复合模型中，EnvCTD的相对位置刚好位于Gag-CA格栅边沿的二次轴处，这就排除了此前研究中推测其位于中心孔的假设。在此种构象下，EnvCTD可以与MA上关键残基发生直接相互作用，而这些残基被认为是Env包装所必需的。为进一步确认结构分析结果，作者还收集了带有ADA.CM全长三聚体的未成熟hVLP冷冻电子断层数据，分析显示其中Gag多聚蛋白的组织形式与前述模型中相似，Env三聚体同样位于Gag-CA格栅的边沿而非中心孔处。
图1未成熟HIV-1病毒颗粒Env-Gag的复合模型
而在成熟病毒颗粒结构中，Gag多聚蛋白已被酶切开，MA层呈断裂状而非前述未成熟颗粒中的连续状态，表明在病毒粒子成熟过程中MA结构需要发生重构。而且此时Env三聚体已不再与MA层位于同一位置。作者推测膜结合的Gag格栅的打断可能有助于Env三聚体获得足够的移动能力以便于介导膜融合过程。
接下来重点分析Env三聚体的结构。作者发现hVLP-Env基本都处于闭合的融合前构象，其胞外段通过一个薄的三脚架样茎环与病毒膜相连（图2）。与未成熟hVLP中的Env结构类似，尽管可在粗断层图像中确认其存在，此子断层平均化结构中Env跨膜区的密度同样不可见。在每个成熟的hVLP上分布有不同数目的Env，数目介于8-82，这些三聚体似乎是随机分布的，无明显的聚集或与其他三聚体形成紧密互作。hVLP基本都呈球状构型，平均直接约nm，故大体估算出一个hVLP上最多可容纳个Env三聚体，因此hVLP上存在的Env三聚体数目远低于其理论上限，这就使得每个Env三聚体有充足的表面区域供其移动。此外，作者还使用氢氘交换质谱（HDX-MS）分析天然hVLP上的Env，确认其处于闭合的融合前构象，且其构象是异质性的；同时通过比较可溶的BG.SOSIP构建，发现两者的整体构象类似，尤其是gp亚基的组织形式，但hVLP-Env在结构上更加规则。
图2平均后的Env密度图与匹配的结构模型侧视图
那gp41亚基呢？hVLP与现有结构的最大差别就在于此。此前发表结构中，Env的HR2螺旋几乎都呈长杆状构象，远端由Asp形成，而在本文获得hVLP-Env中，其HR2螺旋长度减少10个氨基酸，改为由Gln形成远端。HR2C端的其余氨基酸弯折形成一个薄的茎环用以连接胞外段与病毒膜，该三脚架样的茎环使得Env胞外段被抬升远离病毒膜约10。这也使得膜近端外部区域（MPER）的大部分基本都嵌入膜中，这段区域被认为是可以诱导产生某些最广谱中和抗体的理想疫苗靶点。此外，作者还观察到hVLP-Env向膜倾斜，导致子断层平均密度图中茎环区的密度降低。作者推测这种倾斜可能有助于病毒抵抗靶向MPER的中和抗体，中和实验分析也验证了这个猜想。hVLP-Envgp41亚基另一大结构差异是在均一化的结构中位于中心的HR1C末端螺旋（-）的完整密度不可见。作者排除了分辨率和引入对称性的可能影响，HDX-MS分析显示该区域的部分区段具有更强的主链氢键相互作用，对照此前已报道结构说明中心区也存在结构变异性。
最后，作者将目光聚焦在糖基化修饰。此前报道的结构中糖基化位点上的糖修饰往往只能看到核心的N-乙酰葡糖胺，但本文解析的hVLP-Env结构中，延伸的糖基化密度在整个蛋白上均可见到，尤其是在gp和gp41亚基上解析出多个经典位点的糖修饰其密度范围超过现有结构，显示出所谓的“糖被（glycanshield）”。作者分析了受体CD4结合区附近、几株重要中和抗体表位区及融合肽临近区域的糖修饰，显示糖侧链可以通过空间位阻对相应位点提供保护作用。但V3-loop和V1-/V2-loop抗体结合超级位点处的糖修饰则不产生或仅产生微弱的空间位阻，而靶向这些位点的抗体往往需要结合临近的糖侧链方能实现其功能，作者由此推测这可能也是这些位点可以被抗体有效靶向的原因之一。此外，作者还发现某些糖修饰在Env三聚体每个单体上的密度存在差异，显示出糖修饰的异质性。
回顾全文，作者通过冷冻电子断层成像技术解析出天然状态HIV-1病毒颗粒结构：在未成熟颗粒上，Env在底部Gag栅格上的取向呈多样性，该状态的捕获为Env包装的问题提供了一些线索；子断层扫描图平均重建的病毒粒子结构结合结构质谱分析，显示出gp41亚基组成的中心的结构多样性，不同Env单体上的糖基化修饰呈异质化，灵活的茎环允许Env蛋白的倾斜及中和表位的不同暴露方式。上述结果的获得也为HIV-1组装和Env表位呈现的结构多样性提供了新的信息。
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